过表达靶蛋白的稳转细胞株构建

        外源基因在细胞中的表达可分为两大类，一类是瞬时表达，外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，虽然可以达到高水平的表达，但通常只持续几天；一类是稳定表达（构建稳转株），外源DNA整合到宿主细胞染色体上，使宿主细胞可长期表达目的基因。

        建立稳定细胞株，基本原理是将外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上，载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中，用载体中所含的抗性标志进行筛选，得到可稳定表达目的蛋白的细胞株。

      示例：MSLN过表达细胞株的构建

1.       过表达人MSLN蛋白(Q13421)的慢病毒载体构建，其结构图如图 1所示：

Fig.1  MSLN慢病毒载体图谱

2.       将制备的慢病毒载体及慢病毒包装质粒PspaX2、PMD2 .0G转染293T细胞，包装72小时后回收病毒；

3.       检测病毒滴度，以三种不同的滴度感染CHO-K1宿主细胞，24小时后更换培养基；

4.       以未感染慢病毒的CHO-K1细胞（以下称为CHO-K1-blank）为阴性对照组，以感染慢病毒的CHO-K1细胞（以下称为CHO-K1-MSLN）cell pool为实验组，各组加入不同的药物浓度加压筛选，选取适当的药物浓度后扩大培养4-5代。

5.       以梯度稀释法在96孔板中培养CHO-K1-MSLN细胞，5天后观察细胞生长并挑选单克隆细胞进行扩大培养。

6.       取2E5扩大培养的单克隆细胞，FACS buffer洗两遍后加入阳性检测抗体(220812A01)^[1]，如下图所示，流式细胞术检测MSLN蛋白的表达。

流式检测MSLN表达 

        费洛斯的慢病毒感染筛选稳定细胞株平台基于载体中所含的抗性标志进行筛选，常用的真核表达载体的抗性筛选标志物有新霉素（neomycin）、潮霉素（hygromycin）和嘌呤霉素(puromycin)，筛选得到可稳定表达目的蛋白的稳定细胞株，为基础研究（基因功能研究）、药物筛选（CAR开发前期scFv筛选）等提供科研助力。

[1]. Yuchun Gu, Le Yin. A kind of CAR-NK cell preparation method of target mesothelin[P].China.

[2].CN109762844A.2019.05.17